本发明公开了一种生产L-异亮氨酸的工程菌及其应用。本发明提供了将重组质粒导入黄色短杆菌得到的重组菌；所述重组质粒为将ilvBN蛋白的编码基因和ilvAR蛋白的编码基因的表达盒插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述黄色短杆菌的CICC编号为23655；所述ilvBN蛋白如序列表的序列1所示；所述ilvAR蛋白如序列表的序列3所示。本发明的提供的工程菌可直接发酵得到L-异亮氨酸，发酵96小时后，发酵液中的L-异亮氨酸含量高达45g/L，极具生产应用价值。