本发明公开了一种大肠癌特异性抗原肽、大肠癌特异性抗原肽的表达载体以及制备方法，包含表达载体的大肠癌特异性自身抗体酶联免疫检测试剂盒及其操作方法。利用噬菌体将大肠癌cDNA文库展示到噬菌体表面，并经亲和筛选和血清学分析从中筛选出大肠癌特异性抗原肽的表达载体，作为主要组分，与阴性对照、酶标板、显色剂及终止液等构成检测试剂盒。本发明的大肠癌特异性抗原肽的表达载体，有效表达大肠癌特异性抗原肽，包被在酶标板上，具有检测大肠癌病人血清中由于肿瘤刺激所产生的自身抗体的能力，从而达到早期检测和筛选大肠癌病人的目的。