本发明提供一种昆虫中肠细胞的分离及离体培养方法，是将分离的中肠组织用Dispase Ⅱ酶进行酶解。获得的中肠细胞用添加有条件培养基和胎牛血清的TNM-FH培养基进行离体培养。本发明提供了一种简单有效适合昆虫中肠细胞离体培养、中肠生理学以及病理学研究的昆虫中肠细胞分离方法，包括解离中肠细胞所用的酶液，维持细胞离体状态的适合培养基以及血清浓度和添加物，使刚分离下的中肠细胞存活率达80%以上，离体培养60d后的细胞存活率在20%以上，离体条件下中肠细胞可以被核型多角体病毒侵染，并具有碱性磷酸酶等的分泌能力，为从事昆虫中肠生理功能的研究奠定基础。