本发明提供了杂交瘤细胞株2D3、其分泌产生的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体及其应用。杂交瘤细胞株2D3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C201328。杂交瘤细胞株2D3可以用于制备高效价抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，鼠腹水经纯化制得的抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体用酶联免疫吸附分析法（ELISA）测得的效价可达1.5×105。该抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体灵敏度高，对玉米赤霉烯酮的50%抑制浓度IC50为20pg/mL，与β-玉米赤霉烯醇，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉醇的交叉反应分别为84.9%，3.3%，3.2%。可用于玉米赤霉烯酮含量的测定。