本发明公开了一种高效发酵生产L-山梨糖的方法，以固定化基因工程菌为生产种子，接种到种子培养基中，500mL摇瓶装液50mL，于30℃、200rpm条件下增殖培养20-24h；按15%的接种量将培养好的固定化种子接入发酵培养基，30℃，500rpm，2.5vvm，1-L发酵罐条件下半连续补料发酵21天。应用上述方法以山梨醇为唯一碳源，发酵16h后，D-山梨醇转化率达到90%以上，与对照菌株相比提高了37%；以山梨醇为唯一碳源，可完成21天的固定化细胞的半连续补料发酵，与游离菌发酵相比节约20批次的种子制备成本。