本发明公开一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA及制备方法与应用。本发明通过以羊布鲁氏菌M5基因组DNA为模板，PCR扩增得到znuA基因的上、下游同源臂；将znuA基因的上、下游同源臂连接，得到片段ΔznuA；将片段ΔznuA克隆至载体pRE112上，得到自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA；将该质粒导入羊布鲁氏菌M5细胞中，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子，再将同源重组单交换子涂布于选择培养基上，得到羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA。该菌株较M5菌株，具有良好的生长特性和遗传稳定性，毒力小且免疫效果相当，因此，其有望成为新型疫苗进行应用。