本发明公开了一种25-羟基胆固醇的合成方法，包括如下步骤：1）、对24-去氢胆固醇的3-羟基进行保护；得酰化24-去氢胆固醇；2）、将步骤1）制得产物24位上的双键进行环氧化反应：于溶剂Ⅱ中，在锰盐的催化作用下，酰化24-去氢胆固醇与环氧化试剂进行环氧化反应，得到环氧化产物；3）将步骤2）制得产物进行还原开环：在溶剂Ⅲ中，步骤2）所得的环氧化产物与还原试剂进行还原开环反应，得25-羟基胆固醇。本发明的25-羟基胆固醇的合成方法，使用无毒且价格低廉的过氧乙酸、间氯过氧苯甲酸作为环氧化试剂，环境友好；反应在低温下进行，采用锰盐作为催化剂，选择性高。