本发明公开了一种利用聚氨酯海绵作为菌种载体的食用菌菌种的制作方法，包括以下步骤：步骤一：将玉米粉和小麦粉混匀，加水熬制成浆糊，冷却备用；步骤二：将海绵放入浆糊中反复搅拌，使浆糊渗入海绵孔穴中，然后捞出挤压多余的浆糊，再放入干的麸皮中搅拌翻滚，使海绵表面粘附麸皮；步骤三：将粘附麸皮的海绵均匀装入双层聚丙烯袋，表面覆盖细木屑，封口；步骤四：灭菌，冷却后接种，培育。本菌种的制作方法采用海绵作为载体，成品菌种培育后附载在海绵上，可工业化标准化将成品菌种加工成任意物理形状，成品菌种附载在海绵载体上，在使用过程中成品菌种与海绵极易分离，极易捣散，接种过程中不会因捣碎而伤害菌种活力。