本发明公开了一种β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，它按以下步骤进行：在酶标板的板孔中加入合成液，然后加入待测酶样品，在微孔板振荡反应器中，10-30℃，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入PDAB显色液显色，酶标测定其在415nm处的吸光值大小；根据吸光值变化趋势及吸光值的最低值，筛选出活性高、合成能力好的酶；所述合成液是将β-内酰胺抗生素的母核与侧链溶解于KPB溶液中制成；所述待测酶样品为β-内酰胺抗生素合成酶。本发明可以用于用于内酰胺类抗生素如阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄、氨苄西林等酶法合成用酶的筛选。具有操作简单、成本低廉、检测准确等特点，适合大规模高通量筛选合成用酶。