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公开(公告)号：CN103667418B
公开(公告)日：2015-03-25
申请号：CN201310696643.X
申请日：2013-12-18
申请人： 华北制药河北华民药业有限责任公司
IPC分类号： C12Q1/34
摘要： 本发明公开了一种β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，它按以下步骤进行：在酶标板的板孔中加入合成液，然后加入待测酶样品，在微孔板振荡反应器中，10-30℃，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入PDAB显色液显色，酶标测定其在415nm处的吸光值大小；根据吸光值变化趋势及吸光值的最低值，筛选出活性高、合成能力好的酶；所述合成液是将β-内酰胺抗生素的母核与侧链溶解于KPB溶液中制成；所述待测酶样品为β-内酰胺抗生素合成酶。本发明可以用于用于内酰胺类抗生素如阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄、氨苄西林等酶法合成用酶的筛选。具有操作简单、成本低廉、检测准确等特点，适合大规模高通量筛选合成用酶。
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公开(公告)号：CN103695447B
公开(公告)日：2015-10-14
申请号：CN201310557812.1
申请日：2013-11-11
申请人： 华北制药河北华民药业有限责任公司
摘要： 本发明公开了一种新型内酰胺类抗生素合成酶，根据Genebank中无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶氨基酸序列（Genebank：AY919310.1），有如下至少一个位点的突变：第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸、第415位赖氨酸替换为精氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第790位甘氨酸替换为丙氨酸。本发明还公开了所述新型内酰胺类抗生素合成酶的优化编码基因、含有该编码基因的重组载体和重组菌株以及该酶在合成阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛合成中的应用。该酶作为阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等内酰胺类抗生素的合成用酶，具有合成活性高、底物转化率高、侧链比低、应用广泛等优点，具有很好的工业化应用前景。
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公开(公告)号：CN103695405B
公开(公告)日：2015-08-05
申请号：CN201310557791.3
申请日：2013-11-11
申请人： 华北制药河北华民药业有限责任公司
IPC分类号： C12N9/84
摘要： 本发明公开了一种利用特定的工程菌——转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA生产新型内酰胺类抗生素的方法，本发明方法以SEQ ID NO：1所示的青霉素酰化酶氨基酸序列为基础，首先引入突变位点，然后反向设计出核苷酸序列并进行了优化，进而通过进行全基因合成、构建重组载体、构建出重组菌株；所构建的重组菌株经发酵、细胞破碎、分离、纯化、脱色、固定化步骤处理后，最终得到能够直接用于工业生产的新型内酰胺类抗生素固定化酶成品。本发明方法所制备的固定化酶酶活高、稳定性好、重复利用效果优良，并且能够催化多种内酰胺类抗生素的合成如阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等。
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公开(公告)号：CN103695447A
公开(公告)日：2014-04-02
申请号：CN201310557812.1
申请日：2013-11-11
申请人： 华北制药河北华民药业有限责任公司
摘要： 本发明公开了一种新型内酰胺类抗生素合成酶，根据Genebank中无色杆菌属CCM4824青霉素酰化酶氨基酸序列（Genebank：AY919310.1），有如下至少一个位点的突变：第184位天冬酰酸替换为酪氨酸、第330位苯丙氨酸替换为丙氨酸、第415位赖氨酸替换为精氨酸、第454位亮氨酸替换为丙氨酸、第623位天冬氨酸替换为天冬酰胺、第770位亮氨酸替换为苯丙氨酸、第790位甘氨酸替换为丙氨酸。本发明还公开了所述新型内酰胺类抗生素合成酶的优化编码基因、含有该编码基因的重组载体和重组菌株以及该酶在合成阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛合成中的应用。该酶作为阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等内酰胺类抗生素的合成用酶，具有合成活性高、底物转化率高、侧链比低、应用广泛等优点，具有很好的工业化应用前景。
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公开(公告)号：CN103695405A
公开(公告)日：2014-04-02
申请号：CN201310557791.3
申请日：2013-11-11
申请人： 华北制药河北华民药业有限责任公司
IPC分类号： C12N9/84
CPC分类号： C12N9/84 , C12N15/70 , C12Y305/01011
摘要： 本发明公开了一种利用特定的工程菌——转化体BL21(DE3)/PET28-ASPGA生产新型内酰胺类抗生素的方法，本发明方法以SEQIDNO：1所示的青霉素酰化酶氨基酸序列为基础，首先引入突变位点，然后反向设计出核苷酸序列并进行了优化，进而通过进行全基因合成、构建重组载体、构建出重组菌株；所构建的重组菌株经发酵、细胞破碎、分离、纯化、脱色、固定化步骤处理后，最终得到能够直接用于工业生产的新型内酰胺类抗生素固定化酶成品。本发明方法所制备的固定化酶酶活高、稳定性好、重复利用效果优良，并且能够催化多种内酰胺类抗生素抗生素的合成如阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛等。
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公开(公告)号：CN103667418A
公开(公告)日：2014-03-26
申请号：CN201310696643.X
申请日：2013-12-18
申请人： 华北制药河北华民药业有限责任公司
IPC分类号： C12Q1/34
摘要： 本发明公开了一种β-内酰胺抗生素合成用酶的高通量筛选方法，它按以下步骤进行：在酶标板的板孔中加入合成液，然后加入待测酶样品，在微孔板振荡反应器中，10-30℃，反应0.1-3小时，反应过程中每隔1-30分钟取出酶标板加入PDAB显色液显色，酶标测定其在415nm处的吸光值大小；根据吸光值变化趋势及吸光值的最低值，筛选出活性高、合成能力好的酶；所述合成液是将β-内酰胺抗生素的母核与侧链溶解于KPB溶液中制成；所述待测酶样品为β-内酰胺抗生素合成酶。本发明可以用于用于内酰胺类抗生素如阿莫西林、头孢氨苄、头孢克洛、头孢羟氨苄、氨苄西林等酶法合成用酶的筛选。具有操作简单、成本低廉、检测准确等特点，适合大规模高通量筛选合成用酶。
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