本发明公开了一种基于自聚集短肽诱导的固定化腈水解酶及制备方法和应用，制备方法如下：（1）将连接肽与自聚集短肽拼接，构建得到表达载体；（2）将腈水解酶基因与上述表达载体连接，转化入受体菌，获得工程菌；（3）上述工程菌诱导表达后，对细胞进行破壁处理，离心和/或过滤获得沉淀，即腈水解酶体内酶聚集体；（4）将得到的腈水解酶体内酶聚集体在海藻酸盐中固定化，得到固定化腈水解酶。本发明固定化所得腈水解酶聚集体，固定化酶颗粒直径约1mm。该固定化该颗粒可以冻干保存，在37oC情况下保存20天，酶活保留90%，而且固定化的腈水解酶酶活性高，操作流程简单。