本发明公开了一种文库对文库的酵母双杂交规模化筛选互作蛋白质的方法，以基因组规模的cDNA作为Bait筛选同样是基因组规模的cDNA Library。在本技术实施过程中采取对cDNA文库进行均一化处理的方法来降低高丰富度互作蛋白对低丰富度互作蛋白的掩盖作用，提高了筛选的效率；利用酵母URA3基因的特性自动的去除bait cDNA中具有自激活作用的序列。本发明建立了一种可行性高，成本低廉，实验条件要求低，工作量较小的利用文库对文库的酵母双杂交技术大规模筛选互作蛋白质的方法，并成功的应用于了病原物-寄主植物互作蛋白质的筛选。