本发明公开了一种气相色谱-质谱检测土壤溶液中酰基高丝氨酸内酯的方法，属于分析化学技术领域。本发明的步骤为：一、将HSLs标准品用乙酸乙酯配制成标准储备液；二、取土壤分别以土水比1:2、1:5、1:10的比例加入离心管中震荡，取上清液，向上清液中加入混标样品涡旋混匀；三、将乙酸乙酯加入制得的溶液中，萃取、离心，吸取乙酸乙酯相于含有无水Na2SO4的离心管中，漩涡、离心，吸取有机相于进样瓶中；四、进行GC-MS检测。本发明建立了利用GC-MS测定土壤溶液中HSLs的分析方法，操作简便，检测精度高，适用于土壤溶液中多种HSLs信号分子化合物的同时定性与定量分析，为进一步深入研究HSLs信号分子在土壤中的环境行为奠定了基础。