本发明提供一种土壤中大豆根瘤菌分离和固氮活性同步检测方法。将大豆用无菌水洗净后晾干，在无菌风下，用质量浓度0.1％的升汞反复消毒3次以上待用。把蛭石灭菌后，再将消毒后的大豆种子分别粘取土壤和生产中应用的根瘤菌，用不粘任何土壤及根瘤菌的消毒种子做对照，同时播种在营养钵中，并装入带有透气灭菌盖的无菌袋中，在光照培养箱中培养，定期定量浇入灭菌后的霍格兰营养液，直至大豆第4片复叶完全展开，若对照不结根瘤，则采用乙炔还原法测定粘取土壤并结瘤大豆的根瘤固氮酶活性，同时分离该根瘤中的根瘤菌并进行16s rDNA鉴定，与粘取生产中应用的根瘤菌的大豆所结根瘤的固氮酶活性进行对比，保留分离获得的高固氮活性大豆根瘤菌。