本发明属于微生物检测领域，涉及一种基于FISH技术的活细菌定量检测方法。该方法在常规荧光原位杂交方法的实施过程前，增加PMA核酸染料的预处理步骤；在PMA处理过程中，死菌细胞内的核酸与PMA共价结合，在荧光显微镜的蓝光激发下发出橙色荧光，从而可知橙色荧光的细菌为原体系中的死菌，活菌细胞内的rRNA在杂交步骤与荧光探针结合，荧光探针在荧光显微镜的蓝光激发下发出绿色荧光，从而可知绿色荧光的细菌为原体系中的活菌。本发明通过对荧光原位杂交技术的改进，即增加PMA染料处理的步骤，实现了样品体系中死活菌的有效区分，构建出一套可快速定量样品中活性细菌的方法。本方法对细菌定量具有较强的普适性。