本发明公开了一种聚丙烯酰胺凝胶及其在电泳分离小分子蛋白或多肽中的应用。该聚丙烯酰胺凝胶包括独立配制的浓缩胶和分离胶；每份所述浓缩胶原料组成如下：2.67mL水、0.33mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、1mL凝胶缓冲液、30μL过硫酸铵水溶液和3μL四甲基乙二胺；每份所述分离胶原料组成为如下1)或2)：1)2.20mL水、1.2mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、2mL凝胶缓冲液、0.6mL丙三醇、30μL过硫酸铵水溶液和3μL四甲基乙二胺；2)0.88mL水、2.23mL丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺溶液、2.23mL凝胶缓冲液、0.66mL丙三醇、22μL过硫酸铵水溶液和2.2μL四甲基乙二胺。所用电极缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-三羟甲基甘氨酸缓冲体系。本发明易于推广、操作简单、分辨率高、与免疫印迹等兼容性好。