本发明公开了一种突变灰盖鬼伞过氧化物酶、制备方法和应用，属于基因工程及环境技术领域。本发明利用基因合成定点突变平台合成CIPmt4，经3轮易错PCR，抗性筛选得到含5个氨基酸突变(I49S、V53A、T121A、M166F和Y272F)的灰盖鬼伞过氧化物酶CIPmt5，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。该突变酶的最适反应温度由野生型的25℃提高到45℃，最适反应pH由原来的5.0提高到6.5，高活性反应pH变宽，稳定性增强，更适于工业化应用。除次甲基蓝外，突变酶CIPmt5对染料氨基黑、甲基橙、刚果红、苯胺蓝、结晶紫、溴酚蓝的降解最适pH均向中性、碱性方向偏移，并且对7种染料的降解能力均显著高于野生型酶。