生物催化生产磷酸肌酸的方法，涉及磷酸肌酸的制备方法的技术领域。本发明提供的方法主要解决磷酸肌酸现有的生物催化生产方法产率低、成本高的技术问题，该方法具体为以肌酸和三磷酸腺苷为底物，在肌酸激酶突变体的催化作用下生产磷酸肌酸，所述肌酸激酶突变体具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，该氨基酸序列的特点是将肌酸激酶亲本的氨基酸序列中第100位点的Phe突变为Tyr。该肌酸激酶突变体的比活性较肌酸激酶亲本高出111%，该方法使肌酸转化为磷酸肌酸的转化率超过85%，适于大规模工业化生产。