本发明提供了一种双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法和应用。该探针是利用苯并咪唑桥连咔唑衍生物构建基于分子内电荷转移效应的pH荧光探针。制法：将苯并咪唑与咔唑衍生物溶于少量N,N‑二甲基甲酰胺，加入三甲基氯硅烷催化，于封管内反应，然后加入饱和Na2CO3溶液调节pH至弱碱性，减压浓缩、硅胶柱分离得纯品。该探针具有接近溶酶体pH平衡的pKa值。对H+具有高的灵敏度、好的选择性和大的Stocks位移。该探针在结合H+前后颜色变化明显，可裸眼识别。该探针以咔唑衍生物为双光子荧光团，利用双光子荧光成像技术证实该探针与市售绿色溶酶体探针具有良好的共定位性，可应用于HeLa细胞溶酶体内pH变化的检测。