本发明公开了自组装胶原蛋白及其制备方法和用途，其中，自组装胶原蛋白制备方法包括以下步骤：利用胰蛋白酶和碱性蛋白酶对动物源胶原蛋白进行酶解处理，以便获得含有小分子肽的酶解产物；对所述酶解产物进行超滤处理，以便获得胶原蛋白多肽溶液；将所述胶原蛋白多肽溶液与醋酸混合后进行透析处理以便获得所述自组装胶原蛋白，其中，所述透析处理采用磷酸盐缓冲液作为透析外液。该方法采用特定蛋白酶水解胶原蛋白，不仅得到低分子量的胶原多肽溶液，并且可以在肽的末端产生特定的“粘性末端”，通过自组装形成可以在体内起到更好地支撑器官、保护机体作用的胶原纤维。