本发明提供了一种用人尿液细胞作为饲养层培养人诱导多能干细胞的方法。用传代培养、冻存复苏后培养的第三至第十二代的人尿液细胞作为滋养层细胞培养由成年男性包皮成纤维细胞重编的人多能干细胞(hiPS)。本发明使用的人尿液细胞代替传统方法中用的小鼠胚胎成纤维细胞或鼠胚成纤维细胞系，培养人诱导多能干细胞，减少了培养体系中异源细胞的污染，且比间充质干细胞更易获得。并证明了该培养体系可使人诱导多能干细胞在体外扩增，且长期维持了hiPS细胞的生物学特性和多能干性，为hiPS进入临床应用提供了可能。