本发明公开一种人子宫内膜腺上皮细胞的分离培养方法及优化培养基，该优化培养基包括DMEM培养基、F-12 Nutirient Mix培养基、0.5mg/ml的氢化可的松、胎牛血清、25ug/ml的表皮生长因子、5mg/ml的胰岛素、11.7uM的霍乱毒素、10mM的ROCK1抑制剂、10mM的BMP4拮抗剂、10mM的WNT拮抗剂。本发明分离培养人子宫内膜腺上皮细胞的方法，通过将胶原酶IV和Accumax细胞分散液联合消化获得的腺上皮细胞培养于本发明优化的培养基中，使分离得到的人子宫内膜腺上皮细胞传代培养至P1代呈克隆增值，可以有效地将人的子宫内膜腺上皮细胞在体外培养2代，为人子宫内膜腺上皮细胞进行体外细胞互作模型研究提供了一定量的种子细胞。