本发明公开了近亲交配雄性罗氏沼虾遗传多样性分析方法，包括以下步骤：步骤1、采集不同性状的近亲交配雄性罗氏沼虾样品，并提取DNA；步骤2、选择微卫星标记组合，并设计特异性PCR引物组进行扩增；步骤3、评价PCR产物数，观察等位基因分型和大小；步骤4、记录每个雄虾的等位基因数A、等位基因复制数G、观察杂合度Ho、期望杂合度He、基于哈代-温伯格平衡定律的精确偏差值P，并分析微卫星位点差异；根据种群等位基因频率参数计算基因流Nm；用对基因Nei系数法测定基因间距。本发明基于微卫星分析方法，提供了近亲交配雄性罗氏沼虾遗传多样性分析方法，非常适于研究不同的近亲雄虾组遗传结构，为罗氏沼虾优质父本。