本发明提供了耐受过氧化氢的枯草芽胞杆菌脂肪酶突变体及其制备方法，脂肪酶突变体多肽链的氨基酸序列及其基因序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明还包含了所含的脂肪酶突变基因的重组质粒及转化子。本发明利用ESI‑Q‑TOF‑MS分析脂肪酶经过氧化氢处理前后分子量的变化，确定被氧化氨基酸残基类型；进而利用丙氨酸扫描法确定被氧化氨基酸残基的位置；最后，利用定点突变技术和叠加突变技术，构建并筛选出对过氧化氢有良好耐受能力的脂肪酶突变体。利用本方法构建、筛选的脂肪酶突变体，阳性突变率为75%；其中LipA‑Trp42Ala/Met134Glu耐受过氧化氢的C50提高了10倍。