本发明涉及一种检测并区分O型、A型口蹄疫病毒的双联快速检测卡及其制备方法。该检测卡利用双抗夹心ELISA检测抗原的原理，分别将可以特异性识别O型口蹄疫病毒的单克隆抗体mAbI和能特异性识别A型口蹄疫病毒的单克隆抗体mAbII喷到检测膜(硝酸纤维膜)的T1、T2检测线位置制备检测印记；将羊抗或兔抗小鼠IgG或SPA喷到检测膜的质控区C线位置制备质控印记。金标抗体纤维层分为上下两层，分别吸附的是胶体金标记的能特异性识别O型口蹄疫病毒的单克隆抗体mAbIII和能特异性识别A型口蹄疫病毒的单克隆抗体mAbIV。该试纸条可用于快速检测O型、A型口蹄疫病毒(FMDV)感染。应用本发明，操作简单快速，结果清晰易辩，适合基层推广。