一种二甲戊灵半抗原与抗原的制备及应用，其特征在于：所述二甲戊灵半抗原是由3‑(1‑乙基丙氨)‑6‑甲基‑2,4‑二硝基苯甲醛与3‑肼基丙酸反应得到；所述二甲戊灵抗原是由二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联得到。本发明制备的抗原呈现出特异性的二甲戊灵抗原决定簇，使得筛选出高特异性的二甲戊灵单克隆抗体成为可能。产生的抗体特异性高、灵敏度高，可用于建立酶联免疫吸附测定方法和胶体金试纸快速测定法，从而实现烟草及食品中二甲戊灵的快速检测。