一种异菌脲半抗原与抗原的制备方法及应用，异菌脲半抗原是由3,5‑二氯苯异氰酸酯与甘氨酸乙酯盐酸盐反应生成水解得再经成环反应，得3‑(3,5‑二氯苯基)‑2,4‑咪唑烷基二酮，再与6‑氨基己酸甲酯盐酸盐与三光气反应得到的6‑异氰酸基己酸甲酯反应生成6‑(3‑(3,5‑二氯苯基)‑2,4‑二氧咪唑烷基‑1‑甲酰胺基)己酸甲酯，最后在酸性条件下水解得到；异菌脲抗原由异菌脲半抗原与载体蛋白偶联得到。本发明制备的抗原呈现出特异性的异菌脲抗原决定簇，使得筛选出高特异性的异菌脲单克隆抗体成为可能。产生的抗体特异性高、灵敏度高，可用于酶联免疫和试纸快速测定。