本发明属于免疫测定技术领域，具体涉及同时检测妇科肿瘤标志物HER-2和HE4的试纸条及用途，所述的试纸条中的所述硝酸纤维素膜上间隔设置有第一HER-2抗体的第一检测带、第一HE4抗体的第二检测带以及羊抗鼠多克隆抗体的质控带，所述结合垫处喷涂有表面分别修饰了第二HER-2抗体和第二HE4抗体的且含有示踪物的高分子纳米微球。所述试纸条采用时间分辨荧光免疫层析方法能够同时检测人HER-2和HE4两个肿瘤标志物，有助于乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌的同时分析。基于本试纸条一次操作可获得两个结果，因此，提高了筛查和临床判读的效率，减少单独检验造成的误差，有利于妇科肿瘤的筛查和诊断。