本发明涉及一种禽支原体培养基、禽支原体菌液的制备方法及其应用，属于生物技术领域。本发明的禽支原体培养基由基础培养基和辅助成份组成，所述的基础培养基为常规的禽支原体液体培养基，辅助成份为明胶、吐温80和氯化钙；生产用菌种为鸡毒支原体或鸡滑液囊支原体，经菌液接种、培养、收获，生产禽支原体菌液，制得禽支原体疫苗。本发明制备方法提高了禽支原体菌液的抗原含量，简化生产工艺，降低了生产成本，减少疫苗免疫副反应发生几率，提升疫苗免疫效果。