本发明公开了一种光镊中对射光束焦点对准的装置及方法。光源经分束器反射后的光束依次经过第三反射镜和左聚焦透镜后在针孔处聚焦后再依次经过右聚焦透镜、第一和第二反射镜后形成对射光束中的第一光束；光源经分束器透射后的光束依次经第二反射镜、第一反射镜、右聚焦透镜后在针孔处聚焦后再依次经左聚焦透镜、第三反射镜和分束器后形成对射光束中的第二光束。调节针孔和第一反射镜位置以调节对准距离误差，在分束器和第二反射镜之间设置半透光片，调节第二反射镜位置以调节对准角度误差，交替重复上述两个步骤，使得两对射光束焦点的对准距离和对准角度误差同时达到最小。本发明提高了光镊中对射光束焦点的对准精度，具有实际应用价值。