本发明公开了一种稳定携带遗传标记的猪细小病毒感染性克隆系统及其构建方法和应用。在猪细小病毒(PPV)基因组两端的ITR序列中间引入平末端酶切位点，利用In‑Fusion技术，并通过在PPV中间序列引入一个无义突变，获得携带遗传标记并能够与野生毒株进行区分的PPV全长感染性克隆质粒。本发明利用反向遗传操作技术所构建的感染性克隆质粒在体外转染PK15细胞后，经连续盲传可以诱导细胞发生与亲本株相同的细胞病变效应，能够拯救出具有与亲本株生长趋势相似、稳定携带遗传标记的拯救病毒。应用该克隆系统能够快速方便的在基因组的任意位置进行碱基突变，为后续研发猪细小病毒的弱毒苗以及多联苗提供便利、有效的工具。