本发明公开一种检测人明胶酶MMP‑2的荧光多肽底物。所述荧光多肽底物包括如PeptideⅡ所示的氨基酸序列，并且在氨基酸序列第1位的缬氨酸结合荧光基团5‑羧基荧光素，第11位的赖氨酸结合荧光猝灭基团5‑羧基四甲基若丹明。本发明所述的荧光多肽底物与人MMP‑2反应，其酶促反应动力学常数Km为315μM，Kcat/Km：2565M‑1·S‑1；酶活性浓度小于6μM的人MMP‑9与本发明所述的荧光多肽底物几乎无反应。本发明所述检测人MMP‑2活性的荧光多肽底物不与同家族的人明胶酶MMP‑9反应，具有一定的特异性。本发明所述检测人MMP‑2和筛选人MMP‑2抑制剂的方法，操作简便，快捷，具有良好的应用前景。