本发明公开了一种基于FRET的端粒酶活性检测方法，包括以下步骤：首先设计荧光修饰的Flare DNA；再利用四个单链DNA:S1、S2、S3、S4，构建出DNA四面体结构；然后将DNA四面体与Flare DNA进行杂交，获得荧光DNA纳米探针；再将荧光DNA纳米探针与端粒酶混合反应，获取混合物的荧光光谱。本发明设计的基于FRET的荧光探针，可提供精确的检测结果，避免了假阳性信号的产生并使生物成像中系统波动的影响最小化。另一方面，三维(3D)DNA纳米结构具有优异的生物相容性和纳米级可控性，可以通过快速内吞途径进入细胞内，并保持细胞基本的完整性和稳定性，经过合理组装后可应用于生物传感和生物成像。