本发明公开了一种猪伪狂犬病毒gB阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用。该试剂盒包括酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标猪伪狂犬病毒单克隆抗体、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液，其中所述酶标板包被有利用杆状病毒表达系统及细胞悬浮培养工艺表达的猪伪狂犬病毒gB蛋白，将其纯化后作为包被抗原，同时用作免疫原，制备并筛选出伪狂犬病毒gB蛋白的特异性单克隆抗体并进行过氧化物酶标记作为阻断酶标单抗。本发明试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，结果判定采用S/N比值法，准确度高，与进口试剂盒相比，检测符合率达98％以上。