本发明公开了一种分泌抗狂犬病毒M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用，属于生物技术领域。所述杂交瘤细胞株的分类命名为杂交瘤细胞株4A1，于2019年4月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201947。该杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体效价高，特异性好，生物学特性优良；鉴定了其识别RABV M蛋白的精细抗原变异表位，能够用于区分疫苗Flury毒株和其它RABV毒株；将其应用于制备检测狂犬病毒RABV的试剂盒，可以检测RABV感染以及鉴别诊断疫苗Flury毒株和其它RABV毒株。