本发明公开了一种DNA片段及其在构建表达红色荧光蛋白基因的重组流感病毒中的应用。本发明在H9N2流感病毒毒株的NS1基因后面插入mCherry荧光基因，其中，完整NS基因以NS1基因、mCHerry荧光基因和NEP基因依次连接而成，该基因与NEP基因中间用可以被蛋白酶识别并切割的PTV‑1 2A序列相连，从而构成荧光蛋白标记的NS融合基因，其核苷酸如SEQ ID NO:1所示。本发明构建的重组流感病毒为可产生表达红色荧光蛋白的活病毒，其在病毒传代的过程中较为稳定，不影响病毒自身的功能，且生长曲线与滴度与野生病毒株相似，可将其用于后续研究，对抗流感病毒药物的研发、筛选和生产具有重要意义。