本发明提供一种利用Cas9技术构建EFTUD2单等位基因敲除的HepG2.2.15细胞株的方法。利用Ⅱ型CRISPR/Cas9系统，以EFTUD2基因外显子exon3为待敲位点设计合成两条sgRNA并构建质粒载体，将两条质粒载体电转入HepG2.2.15细胞中，经流式分选单克隆培养，获得EFTUD2单等位基因敲除HepG2.2.15细胞模型。本发明的建立的EFTUD2单等位基因敲除HepG2.2.15细胞株，对于研究EFTUD2基因在抵抗HBV感染中的作用及其作用机制具有重要意义。