本发明公开了一种双光子比率型荧光化合物精确测量肿瘤细胞中的氨肽酶N的制备方法，所述荧光化合物结构如式Ⅰ所示。该探针化合物基于荧光共振能量转移原理设计，选择双光子萘衍生物作为能量供体，对甲氨基酚荧光团作为能量受体，引入丙氨酸作为氨肽酶N特异性识别单元。利用氨肽酶N优先水解N‑末端丙氨酰基的能力，导致荧光发射信号比例性的变化。优势在于，具有高灵敏度和高选择性，较大的发射偏移，能够快速检测氨肽酶N。可成功应用于活细胞和组织中的双光子荧光成像，为临床检测肾脏损伤提供了潜在工具。