本发明公开了一种基于CRISPR/Cas12a快速精准检测非洲猪瘟病毒的方法及应用。基于本发明研究，ASF病毒核酸与Cas12a、crRNA形成三元复合体时，该复合物中Cas12a的RuvC结构域行使DNase活性，切割带荧光信号标记的单链DNA，通过检测荧光即可得知待检样品中是否含有ASF病毒核酸。并设计了优质crRNA，构建了快速精准检测非洲猪瘟病毒的方法，对ASF病毒检测效果优异，特异性强、精准度高，灵敏度比荧光定量PCR高10倍以上，反应时间更短，无需昂贵仪器；另外对于病毒含量极低的弱阳性及疑似阳性样品也可通过适当延长反应时间即可确定样品是否含有ASFV。本发明方法能高效、精准检测非洲猪瘟病毒，具有操作简单，无需专业实验室等优点，为该病毒猪场一线快速检测提供有效的方法，对非洲猪瘟早期监测诊断与防控具有重要意义。