本发明属于基因工程技术领域，公开了一种哺乳动物细胞组合表达载体、表达系统、制备方法和应用，该表达载体上插入有ARE序列、IRES序列、WPRE序列以及筛选标记基因序列，所述ARE序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示，所述IRES序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示，组合表达载体的结构为：ARE‑启动子‑目的基因‑WPRE‑IRES‑BSR‑PolyA。该载体利用抗阻遏元件进行载体不同元件的优化组合，一方面克服转基因沉默，另一方面使目的基因在宿主细胞中高效、持久、稳定表达。