本发明提供了利用CRISPR/Cas9敲除文库技术筛选JEV抗性基因的方法与靶点。具体地，本发明提供了一种基于全基因组CRISPR/Cas9敲除文库策略，筛选JEV抗性相关基因的方法及候选靶基因。本发明方法先利用一个包含有针对猪全基因组的sgRNA质粒库包装慢病毒，感染Cas9稳定表达的猪体细胞，通过流式细胞术富集获得全基因组基因敲除细胞库。再利用JEV感染敲除细胞库，收集存活细胞，提取基因组DNA并进行PCR扩增，建库和高通量测序，最后利用生物信息学分析获得数十个JEV抗性候选功能基因。本发明建立了基于全基因CRISPR/Cas9敲除文库策略筛选猪的JEV抗病基因的方法，所鉴定的候选基因靶点可用于抑制JEV复制的靶向药物开发与抗病育种研究。