本发明公开了猪圆环病毒Ⅱ型‑猪塞尼卡谷病毒二联灭活疫苗抗原的制备方法，1）将培养至单层的BHK‑21细胞用胰酶消化，然后加入MEM营养液终止消化，细胞计数后稀释为密度为2×104个/mL的BHK‑21细胞悬液；2）将猪圆环病毒Ⅱ型接种BHK‑21细胞悬液中，培养48h后更换细胞维持液并同时接种猪塞尼卡谷病毒，继续培养；3）接种两种病毒抗原的BHK‑21细胞培养24h左右，根据细胞病变情况收获细胞，收获细胞后的病毒液反复冻融后置于‑40℃以下环境中储存。本发明将猪圆环病毒Ⅱ型和猪塞尼卡谷两种病毒先后都接种于同一种细胞中进行培养，根据细胞病变程度决定抗原收获时间，生产猪圆环病毒Ⅱ型‑猪塞尼卡谷病毒二联灭活苗抗原，提高了生产效率，节约了生产成本，提升了产品质量。