一种荧光亮度确定方法、装置及计算机存储介质，包括：采集在目标通道下光源开启状态时有被测物的第一图像；计算所述第一图像的亮度值；根据所述第一图像的亮度值以及预先计算得到的第二图像的亮度值、所述目标通道的亮度权值和光源亮度增益权值，计算得到不同通道的亮度相对值；其中，所述第二图像为在目标通道下光源开启状态时无被测物的图像；根据所述不同通道的亮度相对值确定被测物的荧光亮度。采用本申请中的方案，可实现被测物的荧光亮度评价，且简单、可操作性强。