本发明提供了一种重组变形假单胞菌及其构建方法和应用，涉及生物工程技术领域，利用重叠PCR、无痕敲除和同源重组技术，构建假单胞菌的gndL(gndC或gndS)和2kgdH的双敲除菌株，阻断其葡萄糖代谢过程中葡萄糖或葡萄糖酸向2-酮基葡萄糖酸的转化，然后利用该菌株转化葡萄糖为葡萄糖酸。在本发明实施例中，将变形假单胞菌JSU01ΔgndLΔ2kgdH的种子培养液接种于发酵培养基中，发酵20h后，变形假单胞菌JSU01ΔgndLΔ2kgdH的发酵液中积累的葡萄糖酸为60.04g/L。