本发明属于生物技术领域，具体公开了一种基于磁性分离和催化发夹组装的外泌体双膜蛋白共表达检测平台及其制备方法与应用，本发明将外泌体与包被抗体CD63的磁珠共孵育，通过磁性分离法分离富集外泌体，以AptEpCAM-T作为外泌体的识别元件及催化反应启动元件，然后与发卡结构H1及发卡结构H2共同构建成检测平台，可实现外泌体双膜蛋白共表达的定性检测。本发明采用磁性分离法有效排除了游离或杂质蛋白的干扰，提高检测的准确性和特异性；并采取催化发夹组装技术将单一的目标蛋白转化为大量可检测荧光信号，提高了检测灵敏度，同时，外泌体双膜蛋白检测的设计还提升了检测效率和诊断效能。