本发明涉及黄蘑菇中天然抗氧化氨基酸衍生物的分离技术领域，具体涉及黄蘑菇中天然抗氧化氨基酸衍生物的定向分离工艺及其应用。其制备方法：提取、微孔树脂柱富集、亲水制备液相色谱分离及亲水制备液相色谱纯化四个步骤。本发明成本低廉、产品纯度大于95%；本发明采用的技术手段可进行规模化生产：原料要求不高、成本低廉，易于批量备料；甲醇室温冷浸提取，易于操作；分离采用微孔树脂柱粗分，该微孔树脂分离材料可以装于中压柱层析系统中，易于规模化；分离纯化中使用的亲水制备液相色谱，为快速的等度方法。