本发明提出一种分析食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的方法，属于稳定同位素技术研究领域。该方法包括1)选择不可交换氢的稳定氢同位素比值已知的糖化合物作为工作标准，发酵，转化成乙醇，测定发酵液中乙醇的氢同位素比值；2)建立δ2H糖不可交换氢＝a*δ2H乙醇+b；3)测定待测食品发酵液中乙醇的氢同位素比值；4)将待测食品发酵液中乙醇的氢同位素比值代入上述关系模型中，得待测食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值。本发明所提出的方法主要用于食品总糖中不可交换氢的稳定氢同位素比值的测定，操作简单，实验成本低，分析快速效率高，安全无风险，适合大批量蜂蜜样品的分析测试。