本发明公开一种EGFR基因缺失突变检测用组合物、试剂盒及检测方法。该组合物包括突变型检测用组合物和/或野生型检测用组合物，所述突变型检测用组合物包括上游引物F1、上游引物F1‑1、水解探针P1和下游引物；所述野生型检测用组合物包括上游引物F2、上游引物F2‑1、水解探针P2和下游引物；其中上游引物F1和F2均是由不匹配区和匹配区组成，上游引物F1和F2的匹配区分别特异性结合待检测序列区域。上游引物F1和F2的不匹配区上均有相对应检测用上游引物和水解探针的相同序列。与现有技术相比，本发明具有显著提高的灵敏度和高度特异性，并且大幅降低了引物和测试成本，具有极高的应用价值。