本发明提供噬菌体裂解酶Lysep3在制备广谱抗菌药物中的应用。本发明首次发现Lysep3对革兰氏阳性菌具有较好的抑制效果，同时在外膜渗透剂的联合作用下对多种细菌具有明显的抑制作用，且具有较低的对小鼠红细胞的溶血活性以及对鼠源巨噬细胞的细胞毒性。此外，本发明以天然噬菌体裂解酶Lysep3为模板，通过优化裂解酶Lysep3基因序列，构建特异表达载体，实现了裂解酶Lysep3在真核表达系统(毕赤酵母)中的表达，并建立完善了蛋白纯化体系，可实现噬菌体裂解酶Lysep3的规模化生产，用于抗菌药物、饲料添加剂等领域，具有重要的应用价值和广阔的市场前景。