本发明公开了一种牛睾丸支持细胞癌细胞及其在痘病毒分离、培养中的应用。所述的牛睾丸支持细胞癌细胞，命名为牛睾丸支持细胞癌细胞BTSCC，其保藏编号为CCTCC NO：C201931。进一步的，本发明还提出了所述的牛睾丸支持细胞癌细胞在分离、培养ORFV和GTPV等痘病毒中的应用。该细胞对ORFV和GTPV细胞毒较为敏感，可以高效增殖ORFV和GTPV病毒，且可以保证病毒的均一、稳定。用该细胞所增殖的病毒滴度与新生牛睾丸支持细胞(NBSC)相当，且生长速度很快，分种率很高，可以用低血清培养条件下生长。利用该细胞分离、培养ORFV和GTPV病毒可提高试验效率，降低试验成本，同时保证了用其制备的疫苗质量的稳定。本发明的提出对痘病毒的培养及其疫苗的规模化生产提供了新的技术手段。